可是在操作過程中總是會(huì)出現(xiàn)或大或小的問題，比如說花板、假陽性、全顯色、信號(hào)值比空白還低等等。
下面就由我拋磚引玉地來說一下，做ELISA試劑盒的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：
1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識(shí)別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時(shí)，師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個(gè)道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對(duì)于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對(duì)其改造再加以包被，我把方法簡要的列出如下：①親和素生物素：先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于。②脂類物質(zhì)：可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。
2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于試驗(yàn)的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)注意以下原理：ELISA試劑盒由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗(yàn)還要有堅(jiān)固的理論外也要實(shí)踐，看一下zui終可不可以應(yīng)用到自己試驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、封閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA；10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%－10％）；還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清 （主要為了排除相似蛋白干擾）和酪蛋白等等。但zui終選用什么，要依據(jù)試驗(yàn)具體來實(shí)踐。
4、洗滌板：可以說在ELISA試劑盒操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)。因?yàn)榫郾揭蚁┑人芰蠈?duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)，在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。所以在洗板時(shí)會(huì)有一定誤差，人為因素很大（當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)除外），洗的不*或串了孔，對(duì)如此靈敏的ELISA試劑盒系統(tǒng)可是不小的影響。
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